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Megazyme 淀粉抗性检测试剂盒K-RSTAR说明书

前言

抗性淀粉（RS）是指在人小肠内不能被酶解的淀粉，在大肠部分或完全发酵。RS是总膳食纤维的组分之一。

原理（AOAC法 2002.02 ;AACC法32-40）

抗性淀粉的测定方法：样品使用α-胰淀粉酶和淀粉葡糖苷酶（AMG）37℃振荡水浴孵育16小时，在这期间，通过两种酶的联合作用，非抗性淀粉被溶解，水解成D-葡萄糖，孵育结束后，加入等体积的乙醇或工业甲基化酒精（IMS,变性乙醇）终止反应。离心上述溶液，收集上清勿弃，底部残留絮状团即为样品中的RS，用含水的IMS或乙醇（50%v/v）洗涤絮状团，洗涤后离心，再重复一次洗涤离心，收集离心后获得的上清，与之前收集的上清混合。小心倒出试管残留的液体，将絮状团置于冰水浴中，加入2M KOH溶解，溶解的同时用磁力搅拌机剧烈搅拌。用醋酸盐缓冲液将这个溶液调至中性，用AMG将淀粉定量水解成葡萄糖。D-葡萄糖用葡糖氧化酶/过氧化物酶试剂（GOPOD）测定，这也是对样品中RS含量的测定。非抗性淀粉（可溶性淀粉）的测定可通过集中的上清液并定容至100mL，再用GOPOD测定D-葡萄糖完成。

应用性和精确性

这个方法需要样品中RS含量多于2% w/w。如RS含量多于2% w/w，常规标准误差为+5%。少于2% w/w RS的误差更高。

试剂盒

瓶子1：淀粉葡糖苷酶AMG，12 mL，3300U/ mL，条件为pH4.5，40℃下，底物为可溶性淀粉，[单位或为200U/mL，条件为pH4.5，40℃下，底物为对硝基苯基β-麦芽糖苷]。AMG溶液应完全没有可检测到的游离D-葡萄糖。4℃下稳定性> 3年。

瓶子2：α-胰淀粉酶(胰酶，10g，3Ceralpha U/mg)。4℃下稳定性> 3年。

瓶子3：GOPOD 试剂缓冲液。磷酸钾缓冲液（1M，pH7.4），对羟基苯甲酸（0.22M）和叠氮化钠（0.4%W/V）。4℃下稳定性> 3年。

瓶子4：GOPOD试剂酶。葡糖氧化酶（>12,000U）加上过氧化物酶（>650U）和4-氨基安替比林（80mg）。冻干粉，-20℃下稳定性>5年。

瓶子5：D-葡萄糖标准溶液（5 mL,1.0mg/mL）溶于苯甲酸0.2%（w/v）。室温下稳定性>5年。

瓶子6：抗性淀粉对照。抗性淀粉含量如表所示。室温下稳定性>5年。

溶液/悬浮液的制备

1.使用瓶子1中提供的的产品（AMG；溶液1）。这个溶液是有粘性的，因此应使用正向移液器？？2ml的，一个（或其他功能相同的装置）移取分装。4℃下稳定性> 3年。

稀释AMG（300 U/ mL）。取2 mL瓶子1中的AMG浓缩液用0.1M顺丁烯二酸钠缓冲液（0.1M，pH6.0下面有清楚解释怎么调pH；试剂1，非提供）稀释至22mL。以5 mL为单位分装后用聚丙烯管？？？冷冻保存。反复冻融不会影响稳定性，稳定性-20℃>5年。

用前制备

2.用100mL顺丁烯二酸钠缓冲液(100mM，pH6.0；试剂1，非提供)悬浮1g？？？怎么取？瓶子2中的产品(α-胰淀粉酶)，搅拌5分钟。加入1.0mL稀释的AMG（300 U/ mL），混匀。>1500g离心10分钟，慢慢倒出上清液，这就是制备的溶液2。溶液2制备后应当天使用。

3.用蒸馏水稀释瓶子3中的产品（GOPOD 试剂缓冲液）稀释至1L，这就是制备的溶液3。制备后马上使用。全部用，下一步里有

备注：

（1）如果浓缩缓冲液在-20℃下储存，它将形成结晶盐，因此必须要完全溶解才可以用蒸馏水稀释。

（2）这个缓冲液包含0.4%（w/v）的叠氮化钠。因此这是个有毒化学物，应进行相应的处理。

4.取瓶3中制备好的溶液320mL溶解瓶子4里全部的产品，定量转移这个溶液至装有剩余溶液3的瓶子中。用铝箔封盖瓶子以遮光。这就是葡萄糖测定试剂（GOPOD 试剂），可以在2-5℃保存3个月或者-20℃下保存一年。

如果试剂要以冷冻态储存，应分装后再冻存。

当试剂是新鲜制备的，它的颜色应是浅黄色或浅粉色。在4℃储存2-3个月时会演变成深粉色。当以蒸馏水为对照时，这个溶液的吸光度应小于0.05。

5&6.使用瓶子5或6提供的产品。室温下稳定性>5年。

没有提供的试剂（应购买分析纯级）

1.顺丁烯二酸钠（马来酸钠）缓冲液(100mM，pH6.0)加上5mM二水氯化钙和叠氮化钠（0.02%w/v）.

用1600mL蒸馏水溶解23.2g顺丁烯二酸，用4M（160g/L）氢氧化钠调节pH至6.0，加入0.74g二水氯化钙和0.4g叠氮化钠，并溶解。定容至2L。4℃下可保存一年。

2.醋酸钠缓冲液（1.2M，PH3.8）

将69.6mL的冰醋酸（1.05g/mL）加至800 mL的蒸馏水中，用4M氢氧化钠调节pH至pH3.8。用蒸馏水定容至1L，室温下可保存一年。

3.醋酸钠缓冲液（100mM，PH4.5）

将5.8mL的冰醋酸加至900 mL的蒸馏水中，用4M氢氧化钠调节pH至4.5。用蒸馏水定容至1L，4℃保存2个月。

4.氢氧化钾溶液（2M）

将112.2gKOH加至900 mL的去离子水中，搅拌溶解。定容至1L，密封保存。室温下可保存2年。

5.含水乙醇（或者IMS）（大约50%v/v）

将500mL乙醇（95%v/v或者99%v/v）或者工业甲基化酒精（IMS；变性乙醇；95% v/v 乙醇加上5%甲醇）至500mL的水中。密封保存，室温下稳定保存>2年。

备注：

一系列包含RS的对照样品0.6%-78%w/w可从Megazyme公司购买。

设备（推荐）

1. 离心式粉碎机，带有齿轮转子和1.0mm筛子，或类似的装置。小型样品可选择旋风磨碎机替代。

2.绞肉机-手动或电动的，装有4.5mm筛。

3.台式离心机-能够放入16×120mm玻璃试管，速度大约1500g(3000rpm)

4.振荡水浴器，可设定为每分钟100次直线运动（振荡速度为每分钟200里程），振荡距离35mm,37℃。

5.水浴锅-能够保持在50+0.1℃。

6.涡旋混匀器。

7.磁力搅拌器。

8.磁力搅拌棒-5×15mm。

9.pH计

10.计时器

11.分析天平（精确到0.1毫克）

12.分光光度计-能够设定510nm（10mm路径长度）

13.100μL移液器及一次性枪头

14.连续分配器-配有50mL管嘴，能够移取2.0mL，3.0mL和4.0mL。

15.培养管-螺旋帽，16×125mm

16.玻璃试管-16×100mm，14mL容量

17.塑料盒，可放置试管架，也可作为冰盒使用。

18.温度计-能够读取37+0.1℃和50+0.1℃。

19.容量瓶-100mL，200mL，500mL，1L，2L

样品制备

用磨碎机研磨大约50g谷物样品或冻干植物或食品，使样品粉末可过1.0mm筛。转移所有的材料至广口瓶，颠倒振荡混匀。工业淀粉一般不用研磨。用绞肉机粉碎鲜样（如罐装的豆子，香蕉，土豆），过4.5mm筛。用AOAC法925.10（15），测定干样中的含水量，根据AOAC法925.10，冻干后烘炉干燥测定鲜样中的含水量。

分析方法

（a）水解和溶液化非抗性淀粉

1.准确称取100mg（±5 mg）样品后直接倒入有螺旋帽的试管里，轻柔的拍打试管以保证样品集中在底部。

注意：对于湿样，样品大概为0.5g(准确称重)，这些材料的含水量通常为60-80%。

2.每个试管中加入4.0 mLα-胰淀粉酶（10 mg/mL）其中含有AMG（3 U/mL）（溶液2）

3.盖紧试管盖子，用涡旋振荡器混匀，卧式放入振荡水浴器，与运动方向平行。

如下图所示：

4.连续振荡，37℃孵育，精确孵育时间为16小时。（备注：200里程/min）

5.把试管从水浴锅中拿出，用纸巾擦掉多余的水。拿开盖子，加入4.0mL乙醇（99% v/v）或者IMS（99% v/v），用涡旋器涡旋。

6.1500g离心，10分钟（不加盖）

7.小心倒出上清，加入2mL 50%乙醇或50% IMS重悬浮，用涡旋器涡旋，再加入6mL 50%IMS，混合，1500g离心，10分钟

8.小心倒出上清，重复上述重悬浮和离心步骤。

9.小心倒出上清，翻转试管，用纸巾吸除多余的液体。

（b）测定抗性淀粉含量

1.将试管冰浴，再向每个试管中加入磁力搅拌棒和2 mL2M的KOH，用磁力搅拌机在冰浴/水浴状态下搅拌20min，以重悬浮絮状物和溶解RS。

如下图所示：

备注：

（1）不要使用涡旋器混匀，那将会导致淀粉乳化。

（2）确保边加入KOH溶液边剧烈搅拌试管里的样品。这将会避免形成难溶的淀粉块。

2.向每个试管中加入8 mL1.2M的醋酸钠缓冲液（pH3.8），并用磁力搅拌机搅拌。立即加入0.1mLAMG（溶液1；3300U/mL）,混匀，并放入50℃水浴。

3.孵育30min,期间用涡旋器间歇混匀。

4.对于RS含量>10%的样品，用水洗瓶定量转移试管里的样品至100mL容量瓶，当用洗瓶洗涤试管中的溶液时用外磁铁保持试管中的磁力棒。用蒸馏水定容至100mL，并混匀。以单位体积离心溶液，1500g，10min。

5.对于RS含量<10%的样品，直接离心1500g,10min（非稀释）。对于这些的样品，试管里的最终体积大约为10.3mL（体积可能会变化，如果分析的是湿样，在计算数值时应注意折扣）

6.将稀释的（4.）或非稀释的（5.）上清液以0.1mL为单位转移至玻璃试管（16×100mm），一式两份，加入3.0mLGOPOD试剂（溶液4），50℃孵育20分钟。

7.测量每一个溶液的在510nm下相对于空白试剂的吸光度值。

制备空白试剂

准备空白试剂：通过混匀0.1mL的100mM的醋酸钠缓冲液（pH4.5）和3.0mL的GOPOD试剂

制备D-葡糖糖标准品（一式四份）通过混合0.1mLD-葡萄糖（1mg/mL）和3.0mL的GOPOD试剂制备D-葡糖糖标准品。

（c）计算非抗性（可溶性的）淀粉

1.收集起始孵育[(a)7.]过程中离心获得上清液和两次50%乙醇洗涤[(a)8.和9.]获得的上清液至容量瓶中。用100mM的醋酸钠缓冲液（pH4.5）定容至100mL。混匀。

2.以0.1 mL为单位孵育溶液（一式两份）并加入10μL稀释的AMG溶液(300U/mL), 50℃孵育20分钟,加入3.0 mL GOPOD试剂（溶液4），50℃孵育20分钟。

3.计算在510nm下相对于空白试剂的吸光度值。

4.计算非抗性淀粉的含量。

计算

计算样品中抗性淀粉含量，非抗性淀粉含量和总淀粉含量（%，在干重的基础上），计算模板如下：

抗性淀粉（g/100g样品）（样品包含>10%RS）

=⊿E×F×100/0.1×1/1000×100/W×162/180

=⊿E×F/W×90

抗性淀粉（g/100g样品）（样品包含<10%RS）

=⊿E×F×10.3/0.1×1/1000×100/W×162/180

=⊿E×F/W×9.27

非抗性淀粉含量（g/100g样品）

=⊿E×F×100/0.1×1/1000×100/W×162/180

=⊿E×F/W×90

总淀粉含量=抗性淀粉含量+非抗性淀粉含量

⊿E=相对于空白试剂的吸光度值

F=从吸光度值到微克的转换（在GOPOD反应中100μgD-葡萄糖的吸光度值是确定的，F=100（D-葡萄糖的μg数）除以这100μgD-葡萄糖的GOPOD吸光度值）

100/0.1=体积校正（从100mL取0.1mL）

1/1000=从微克到毫克

W=分析样本的干重

=重量×（100-含水量）/100

100/ W=RS在样品重量中百分比因子

162/180=从测定获得的游离D-葡萄糖转换到淀粉中存在的脱水-D-葡萄糖的因子

10.3/0.1=体积校正（从10.3 mL取0.1mL），对于含有0-10%RS，当孵育溶液时没有被稀释，最终体积为-10.3 mL。当分析湿样时，体积会增大，在计算时应计算折扣。

表1.使用试管内分析方法获得的RS值与活体结果的比较

淀粉来源	RS(试管内分析方法/结果)^a					RS(活体)
淀粉来源	Englyst	Faisant	Champ	McCleary	Goni^b
马铃薯淀粉（土著）	66.5	83.0	77.7	77.0	-	78.3
高直链淀粉玉米淀粉（土著）	71.4	72.2	52.8	51.7	-	50.3
高直链淀粉玉米淀粉（退化）	30.5	36.4	29.6	42.0	37.8^b	30.1
豆片	10.6	12.4	11.2	14.3	15.3^c	9-10.9
玉米片	3.9	4.9	4.3	4.0	4.7^c	3.1-5.0
罐装豆子	17.1	-	17.1	16.5	-	16.5
ActiStar^d	63^d	-	57^d	58.0	57^d	54^d

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